Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry
细胞表面抗原免疫荧光染色（流式分析）
产品标签：
Cell surface antigen 细胞表面抗原；RBC Lysis Buffer 红细胞裂解液；TruStain FcX™ Fc受体封闭剂；Flow cytometry（FC）流式分析；cell staining buffer 细胞染色缓冲液；
背景描述：
通过荧光标记抗体和流式细胞术检测，细胞表面标记（Cell surface marker）能够用来确定细胞亚群，基于来源，发育阶段和功能。这些表面标记呈现不同形式和功能，包括识别可溶性和细胞连接配体的受体，离子通道，糖蛋白，磷脂等。比如CD4是辅助性T细胞（Th细胞）的表面标记，基于其他趋化因子受体和白细胞分化抗原标记能进一步被分类鉴定。
细胞表面抗原免疫荧光染色-流式分析步骤：
此步骤做交流学习用，具体的实验方案因实验而异。
A．组织和细胞收集
1. 收集理想组织（如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓）并制备悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）的单细胞悬液。如果使用体外刺激细胞，只需将刺激活化的细胞简单悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）。
2. 加细胞染色缓冲液（cell staining buffer）高达~15ml，然后350xg离心5min，吸掉上清。
B．红细胞裂解
3. 用3ml红细胞裂解液（1× RBC Lysis Buffer）重悬细胞或根据具体情况加入相应量的红细胞裂解液。冰上孵育5min。
4. 加10ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）到管内终止细胞裂解，然后350xg离心5min，吸掉上清。
5. 如步骤2重复一次清洗。
6. 细胞计数，用细胞染色缓冲液冲重悬细胞使浓度为5-10 x 106cells/ml，按照100µl/管分装细胞悬液到12 x 75mm塑料管中（5-10 x 105cells/ml）。
C．Fc受体封闭
7. 阻断Fc受体的试剂适用于降低非特异性免疫荧光染色。小鼠样本，使用特异性结合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体可用于封闭抗体的非特异性染色。此种情况下，100 µl染色体积按照每106个细胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体，混匀，冰上孵育5-10min。
8. 人样本，每100 µl染色体积加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution，Fc受体封闭剂)，混匀，室温孵育5-10min。在不含有有效/可得的封闭抗体情况下，使用过量的相同物种来源的纯化IgG和免疫荧光染色用抗体相同来源的IgG亚型作为替代方法来封闭细胞。
D．抗体的细胞表面染色
9. 按照预先优化的浓度，加入合适的荧光素、生物素偶联抗体或纯化的一抗（如：anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC），冰上避光孵育15-20min。
10. 至少使用2ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）清洗细胞，350xg离心5min，吸掉上清。重复一次。
11. 如果使用纯化的一抗，需在残留的缓冲液中重悬细胞，加入预先优化浓度的荧光二抗，冰上避光孵育15-20min。
12. 重复步骤10。
13. 用0.5ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）重悬细胞，每106个细胞加入5µl（0.25µg）7-AAD染色液（7-AAD Viability Staining Solution）对死细胞染色。
14. 避光冰上孵育3-5min。
15. 用流式细胞仪分析结果。
【注意】：如果不能立即使用流式细胞仪分析样品，避光保存样品，并且置于4-8℃保存。样品必须重悬于细胞染色液中。注意细胞样品不应该放在固定缓冲液更长时间，因其会影响荧光素构象和荧光信号。
实验用产品信息：
| 品牌 | 货号 | 名称 | 规格 | 价格（元） |
| MKbio | MX1501-100ML | Red Blood Cell Lysis Buffer 红细胞裂解液 | 100ml | 120 |
| MKbio | MX1504-500ML | Cell Staining Buffer 细胞染色缓冲液 | 500ml | 250 |
| MKbio | MX1505-50T | Fc Receptor Blocking Solution, Human | 50T | 1060 |
| Biolegend | 422301 | Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) | 50T | 1190 |
| Biolgend | 422302 | Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution) | 200T | 2730 |
| MKbio | MX4216-150T | 7-AAD Viability Staining Solution 7-AAD细胞活力染色液 | 150T | 150 |
| BD Falcon | 352063 | 5ml圆底试管（流式管）12X75MM聚丙烯锁扣帽 | 25个/包 | 56 |
| BD Falcon | 352063 | 5ml圆底试管（流式管）12X75MM聚丙烯锁扣帽 | 500个/箱 | 732 |
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归集奇生物/MKBio懋康所有】