描述
Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF488A-conjugated
重组霍乱毒素B亚基（CF488A标记，绿色荧光）
产品信息
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产品名称 |
产品编号 | 规格 |
价格（元） |
| 重组霍乱毒素B亚基 （CF488A标记，绿色荧光） | MX0940-100UG | 100μg |
4278 |
背景描述
霍乱毒素（Cholera toxin，CTX）是霍乱弧菌产生的毒力因子，会引起严重腹泻以及人体脱水。CTX属于AB5亚基家族。天然六聚体蛋白含两个亚基，分子量约85kDa。由一个A亚基（约27.2kDa）和五个B亚基（约11.6kDa/亚基）组成，B亚基以五聚体环的方式排列，呈明显的五度对称，负责毒素识别并吸附细胞表面的神经节苷脂GM1。A亚基催化刺激性G蛋白α亚基（Gαs）的ADP核糖基化，降低GTPase活性和活化α亚基。Gαs的活化引起腺苷酸环化酶（AC）活性增加，进而促使cAMP水平提高。A亚基还能ADP核糖基化视杆细胞外节膜盘的转运蛋白，使得GTPase失活。霍乱毒素还是一种高效的黏膜疫苗佐剂，通过抑制IL-12生产来诱导2型辅助性T细胞的免疫应答。
霍乱毒素B亚基（CTB）对细胞无毒，本质上不含腺苷酸环化酶活性。CTB通过结合神经节苷脂GM1附着到细胞上，是小胶质细胞的良好标记物（这类细胞表面富含神经节苷脂GM1），但不适合标记少突胶质细胞或星形胶质细胞。CTB是利用组化方法研究轴突运输的优秀示踪剂。CTB也是常用的脂筏标记物，脂筏是富含胆固醇和鞘脂的膜微区，在细胞信号转导和蛋白质运输中发挥重要作用。
产品描述
本品是偶联上绿色荧光素-CF488A（Ex/Em=490/515nm）的重组霍乱毒素B亚基（rCTB），即Recombinant Cholera Toxin B subunit, CF488A-conjugated，简写：CF488A conjugated- rCTB，适用于神经学研究中的束路追踪，靶向神经节苷脂GM1）结合和逆行运输。也可在活细胞或固定细胞成像中用作脂筏标记物和内吞示踪剂。
保存与运输方法
保存：-20℃保存，至少6个月有效。
运输：冰袋运输。
产品特性
1） 同义名：Choleragenoid; CTB; CTxB；霍乱毒素B亚单位；
2） 来源：大肠杆菌
3） 登录号：P01556
4） 分子量：~11.6kDa（含103个氨基酸的单一非糖基化肽链，Thr22-Asn124）
5） 纯度：≥98%（SDS-PAGE）
6） 外观：无色溶液（溶于5mM PB, pH7.0, 75mM NaCl, 50% glycerol，经0.2μm滤膜过滤除菌）
7） 内毒素：≤0.1 EU/µg（LAL method）
注意事项
1） 本品以冻干粉形式提供，由于量比较少，初次使用前需置于室温回温至少30min，低速离心后，再开盖直接往瓶内加入合适的溶剂进行溶解。
2） CF系列荧光染料是Biotium的注册商标，Alexa Fluor和DyLight系列染料是Thermo Fisher的注册商标，Cy系列染料是Cytiva的注册商标。
3） 本品仅供科研用途，绝不可以用于临床或诊疗用途。
4） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
以下是用荧光标记的rCTB对细胞进行标记的实验流程。对于其他的应用（比如：神经示踪），请根据应用查找相应的文献作为参考。
一、 自行准备材料
1.1 磷酸盐缓冲液（PBS）（比如：MS3552-500ML）
1.2 牛血清白蛋白（BSA）（比如：MP6101-5G）
1.3 HBSS（比如：MS3505-500ML）
1.4 4%多聚甲醛（比如：MM1504-500ML）
1.5 【可选】Hoehcst 33342（比如：MX4203-10MG，MX4203-1ML，MX4204-10ML）
二、 染料准备
重溶：将低温保存的CF488A conjugated- rCTB（规格：100μg）置于室温回温至少30min，低速离心3-5min，将粉末离心至管底。直接往瓶子加入100μl无菌水或1×PBS使其充分溶解，即得到1mg/ml的母液。
保存：新鲜制备的CF488A conjugated- rCTB（1mg/ml）置于+4℃避光保存，3个月稳定。亦可根据单次用量分装后，置于-20℃避光保存，6个月稳定，避免反复冻融。
三、 活细胞的表面标记
3.1用4℃预冷的HBSS+0.5% BSA清洗细胞一次；
3.2用4℃预冷的HBSS+0.5% BSA稀释CF488A conjugated- rCTB（1mg/ml）到工作浓度：400ng/ml-1μg/ml。
3.3吸走细胞内的缓冲液，加入新鲜配置的CF488A conjugated- rCTB染色工作液。+4℃避光孵育30min。
3.4用4℃预冷的HBSS+0.5% BSA清洗细胞三次；
3.5用4%多聚甲醛固定细胞，+4℃避光固定15min。
3.6用PBS清洗细胞二次，之后进行成像或接着做后续的染色。【注：根据实验需求，考虑是否加入核复染剂-Hoechst 33342等】
应用实例（来自文献，仅做参考）
Ref1）Arachchige SP, Henke W, Kalamvoki M, Stephens EB. Structural Domains of the Herpes Simplex Type 1 gD Protein that Restrict HIV-1 Particle Infectivity. J Virol. 2021 Mar 25;95(8):e02355-20. doi: 10.1128/JVI.02355-20. Epub 2021 Feb 3. PMID: 33536165; PMCID: PMC8103709.
实验目的：脂筏鉴定（Identification of lipid rafts）
实验方法：COS-7细胞（转染pcDNA3.1或pcDNA3.1(+)-HSV-1 gD）于37℃培养24h。吸走培养基，用HBSS-BSA清洗，加入CF488A标记的霍乱毒素B亚基（1μg/ml）于冰上孵育30min。细胞用HBSS-BSA和PBS清洗。用4%多聚甲醛固定15min，用PBS清洗，之后用含5%BSA的PBS孵育1h。为了共定位gD和GM1，用小鼠抗gD的单克隆抗体室温孵育1h。载玻片用PBS清洗后，用Aleca Fluor 594标记的兔抗小鼠IgG孵育1h，之后用DAPI（1μg/ml）复染5min。盖玻片清洗后用含甘油的封片剂封片。CF488A标记的霍乱毒素B亚基用FITC滤片观察，HSV-1 gD用Alexa 594抗体染色用Texas Red滤片观察。
实验图片：
Fig.Expression of gD results in colocalization with ganglioside GM1. COS-7 cells were transfected with a vector expressing gD for 48 h, and cells were reacted with cholera toxin subunit B (CTB) tagged with Alexa Fluor 488. The cells were fixed (but not permeabilized) and reacted with a mouse monoclonal antibody against gD, then washed and reacted with a secondary goat anti-mouse monoclonal antibody tagged with Alexa Fluor 594. Cells were once again washed, mounted, and examined using a Leica TCS SPE confocal microscope with a 63×objective with a 2×digital zoom and the Leica Application Suite X (LAS X) software package. A 405-nm filter was used to visualize DAPI, a 488-nm filter was used to visualize CTB, and a 594-nm filter was used to visualize gD staining.
Ref2）Yasuda M, Nagappan-Chettiar S, Johnson-Venkatesh EM, Umemori H. An activity-dependent determinant of synapse elimination in the mammalian brain. Neuron. 2021 Apr 21;109(8):1333-1349.e6. doi: 10.1016/j.neuron.2021.03.006. Epub 2021 Mar 25. PMID: 33770504; PMCID: PMC8068677.
实验目的：视网膜膝状体投射的顺行标记
实验方法：小动物麻醉后，眼内注射CF594或CF标记的霍乱毒素B亚基（CTB,1mg/ml in PBS）进入眼内标记P2或P14位的RGC轴突。CTB注射后24h（P3或P15），小鼠经心脏灌流PBS，之后灌注4%多聚甲醛（PBS）。摘除大脑和眼睛，之后置于4%多聚甲醛（PBS）固定过夜，进行后续分析。
示例图片：
Fig 2(J–N) JAK2 activation promotes eye-specific segregation. (J) Schematic diagram of RGC projections to the dLGN, labeled with CTB (CF594 = green; CF660R = pink). Chx10-Cre;SOCS3fl/fl (SOCS3 KORGC) mice received intraocular injections of CTB at P14. dLGNs were analyzed at P15. (K) Projection patterns of Control and SOCS3 KORGC RGC axons to the dLGN.“Overlap”shows the overlapped region between CTB594 and CTB660R signals (5% intensity threshold).
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— —Written/Edited by V. Shallan【版权归集麒生物/MKBio懋康所有】
