描述
7-AAD Cell Cycle Analysis Kit细胞周期检测试剂盒
产品信息
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产品名称 |
产品编号 | 规格 | 价格（元） |
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7-AAD Cell Cycle Analysis Kit 细胞周期检测试剂盒 |
MX3236-50T | 50T | 700 |
| MX3236-100T | 100T |
1120 |
|
| MX3236-200T | 200T |
1720 |
产品描述
7-AAD细胞周期检测试剂盒（7-AAD Cell Cycle Analysis Kit）是一款采用7-AAD染色法进行细胞周期检测的试剂盒，通过流式细胞仪进行分析。本试剂盒通常用于贴壁细胞或悬浮细胞的细胞周期检测。对于组织样品，需经消化成单细胞后才可用此试剂盒进行检测。
7-氨基放线菌素D（7-Aminoactinomycin D,7-AAD）是一种不具有膜渗透性的DNA结合染料（选择性插入DNA的GC富集区），通常被活细胞排除在外。活细胞和早期凋亡细胞排斥7-AAD不被染色，但具损伤质膜或受损/无代谢活动的细胞无法阻挡染料进入而被染色。7-AAD/DNA复合物能被488nm的氩离子激发器，发生大的斯托克斯迁移，最大发射波长在647nm。细胞经7-AAD染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么，含双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度介于1-2（见附图I）。
产品组成
| 组分编号 | 组分名称 | 保存方法 | 产品编号（规格） | ||
| MX3236-50T | MX3236-100T | MX3236-200T | |||
| MX3236-A | 染色缓冲液 | +4℃ | 5ml | 10ml | 20ml |
| MX3236-B | 7-AAD染色液（25×） | +4℃避光 | 0.2ml | 0.4ml | 0.8ml |
| MX3236-C | RNase A（50×） | -20℃ | 0.1ml | 0.2ml | 0.4ml |
保存与运输方法
保存：染色缓冲液+4℃保存，7-AAD染色液+4℃避光保存，RNase A-20℃保存，一年有效。
运输：冰袋运输。
注意事项
1） 因7-AAD也能结合RNA，因此，试剂盒内提供RNase A用来降解RNA，以降低背景荧光。然而，虽有资料显示，7-AAD不和RNA结合，但从我司的实验数据来看，添加RNase处理的效果更好。
2） 因7-AAD不具有细胞膜渗透性，则需先对细胞进行乙醇固定，再进行后续染色。
3） 请自行准备95%乙醇和PBS。
4） 荧光染料均存在荧光淬灭，保存和使用过程中请注意避光，以减缓淬灭。
5） 因7-AAD对人体有刺激性，请注意适当防护。
6） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法
一、 染色步骤
1.1 细胞样品的准备：每个样品的细胞数量可以为500万以上。
a）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。用胰酶消化细胞，直至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心3-5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。
b）对于悬浮细胞：1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50µl左右的PBS，以避免吸走细胞。再次加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。
c）对于组织样本：用剪刀将组织剪成尽量小的小块后，用0.25%胰酶消化30-60min（或根据实际情况选择适当的混合酶来进行组织消化），经过200-400目细胞筛网过滤得到单细胞悬液。然后参照步骤b）对于悬浮细胞来准备样品。
1.2 细胞固定：取4ml冰浴预冷的95%乙醇，一边低速涡旋震荡的同时逐滴加入1ml细胞悬液（冰上操作），混匀后于4℃固定2h或更长时间，固定12~24h可能效果更佳。1500rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的乙醇固定液，以避免吸走细胞。加入约5ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50µl左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹动离心管底以分散细胞避免细胞成团。
1.3 7-AAD染色工作液的配制：参照下表根据实际检测样本的数量配制足量的7-AAD染色工作液【注意：7-AAD染色工作液短时间可4℃保存，但需当日使用】。
| 1个样品 | 5个样品 | 10个样品 | |
| 染色缓冲液 | 0.1ml | 0.5ml | 1.0ml |
| 7-AAD染色液（25×） | 4μl | 20μl | 40μl |
| RNase A（50×） | 2μl | 10μl | 20μl |
1.4 染色：每管细胞样品中加入0.1ml 7-AAD染色工作液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光孵育30min。随后可置于4℃或冰浴避光存放。
1.5 加入2ml PBS，1500rpm离心5min，去上清。
1.6 加入500μl PBS，流式细胞仪上机检测。【请在24h内完成流式检测，最好能在当天完成流式检测。】
1.7 流式检测与分析：用流式细胞仪在激发波长488nm处检测红色荧光（7-AAD通道或PerCP通道），同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行DNA含量和光散射分析。
【注意】：上机时，荧光通道设置为线性放大（Linear Scale）；k数据分析，去除粘连细胞。
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附图I.典型的7-AAD细胞周期示例图（参考用）
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归集麒生物/MKBio懋康所有】