Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基荧光素
Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基荧光素
专题关键词：
Aminophenyl fluorescein (APF)；Hydroxyphenyl fluorescein (HPF)；Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物质；DCFH-DA；CAS：359010-69-8；
基本描述：
氨基苯基荧光素（APF）和羟苯基荧光素（HPF）是由T. Nagano开发的两种活性氧（Reactive oxygen species, ROS）指示剂，比H2DCFDA（DCFH-DA, DCFH）具更优秀的特异性和稳定性。APF和HPF显示有限的非选择性反应，和相对较高的光诱导氧化抗性。APF和HPF具细胞膜渗透性，本身无荧光，直到与羟基自由基或过氧亚硝基阴离子反应，还能与次氯酸阴离子反应，产生强绿色荧光（Ex/Em，~490/515nm），可用荧光显微镜、高通量成像仪、荧光酶标板或流式细胞仪检测。
工作原理：
中性溶液中氨基苯基荧光素（APF）和羟苯基荧光素（HPF）几乎是无荧光，当与高活性氧物质（highly reactive oxygen species, hROS）反应，能够生成具有高荧光强度的荧光素（Ex/Em, 490/515nm），且能观察到荧光强度的增加【见下反应原理图】。
探针特征：
□ APF，HPF选择性检测hROS比如羟基自由基（HO•）和过氧亚硝基阴离子（ONOO–），但不会与其他活性氧物质反应（•O2–,1O2, H2O2, NO等）；
□ 通过加入辣根过氧化物酶（HRP）能定量测定过氧化氢H2O2;
□ 结合使用HPF和APF能特异性检测次氯酸（OCl-）;
□ HPF和APF本身根本不会自氧化，从而与其他试剂相比能得到更可靠的数据；
□ 能对活细胞进行成像检测；
ROS探针检测特异性比较：
□ 试剂配制：1mg HPF/APF分别溶于DMF配制成5mM储存液。使用前用磷酸盐溶液（0.1M, pH 7.4）稀释500~5000倍（10～1μM）。将稀释液加入样本并孵育，然后测定荧光值（Ex/Em, 490/515nm）。
□ 磷酸盐缓冲液体系（0.1M, pH 7.4），每一种荧光试剂（终浓度：10μM，0.1% DMF用作共溶剂）与各种活性氧物质反应。
□ HPF（Ex/Em=490/515nm）, APF（Ex/Em=490/515nm）, DCFH（Ex/Em=500/520nm）的荧光强度测定。
表1. 活性氧探针（HPF, APF, DCFH）对各种活性氧物质的反应特异性
| ROS | ROS产生方法 | HPF (MX4805) | APF (MX4804) | DCFH (MX4802) |
| HO• | 100 µM高氯酸亚铁(II)+1 mMH2O2 | 730 | 1200 | 7400 |
| ONOO– | 3 µM (终浓度) ONOO– | 120 | 560 | 6600 |
| OCl- | 3 µM (终浓度) OCl- | 6 | 3600 | 86 |
| 1O2 | 100 µM 3-(1,4-dihydro-1,4-epidioxy-1-naphthyl)propionic acid | 5 | 9 | 26 |
| •O2– | 100 µM KO2 | 8 | 6 | 67 |
| H2O2 | 100 µM of H2O2 | 2 | ＜1 | 190 |
| NO | 100 µM NOC-7 | 6 | ＜1 | 150 |
| ROO• | 100 µM AAPH | 17 | 2 | 710 |
| Autoxidation | 荧光光照2.5h | ＜1 | ＜1 | 2000 |
ROS探针应用示例：
示例1：细胞经光诱导的自氧化检测（Light-induced autoxidation in cells）
1.1 探针加量：37℃避光孵育细胞30min，HPF或DCFH-DA（10μM each）
1.2 荧光测定：共聚焦显微镜观察荧光（激发波长488nm，检测波长＞515nm）；488nm波长辐射刺激细胞10s，然后再测定荧光。
1.3 实验图片：
示例2：猪中性粒细胞的体内成像（Bioimaging of porcine neutrophils）
2.1 猪中性粒细胞的纯化
a）从猪血中纯化中性粒细胞；b）将纯化的中性粒细胞溶于KRPD缓冲液（Krebs-Ringer phosphate buffer）(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4)，置于冰上直至使用。将其转移到培养皿内。
2.2 探针加载与PMA刺激
a）加10μM HPF或APF到细胞，室温孵育30min。b）加入佛波酯PMA（2ng/ml）刺激中性粒细胞；
2.3 中性粒细胞的体内成像
刺激前或刺激后10min用共聚焦显微镜观察中性粒细胞（激发波长488nm，观察波长505nm-550nm）。
图. 中性粒细胞次氯酸阴离子（OCl-）检测。同时加载两个样品，一个用HPF检测，另一个用APF检测。OCl-的生成通过APF检测能看到荧光增强，通过HPF检测几乎看不到荧光变化。
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| 货号 | 名称 | 规格 | 价格（元） |
| MX4804-1MG | Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基荧光素 | 1mg | 2080 |
| MX4805-1MG | Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基荧光素 | 1mg | 2080 |
| MX4802-50MG | H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧（ROS）荧光探针 | 50mg | 546 |
【温馨提示】：见我司（懋康生物）整理的Probes for reactive oxygen species（活性氧探针）产品专题。
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| 货号 | 名称 | 规格 | 价格（元） |
| MX4801-1KIT | Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit
活性氧（ROS）检测试剂盒 |
100~500T | 328 |
| MZ2401-100UL | PMA (TPA, 5mg/ml)佛波肉荳蔻醋酸（5mg/ml） | 100μl | 280 |
| MS5603-50ML | tert-Butyl hydroperoxide solution (TBHP)
叔丁基过氧化氢溶液 |
50ml | 98 |
| MP5429-10MG | N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)
N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸 |
10mg | 588 |
| M36008（Invitrogen） | MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | 50 µg | 650 |
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归集奇生物/MKBio懋康所有】